ESPCI- Projet Light Sheet Fluorescence Microscopy [FR]

[Rencontre avec]

Emna, Xiangdong, et Lilian, élèves-ingénieurs ESPCI

 

 

Bonjour, pouvez-vous vous présenter rapidement et nous expliquer ce qu’est l’ESPCI ?

Bonjour !
Nous sommes Emna, Xiangdong et Lilian, 3 élèves-ingénieurs en 2ème année à l’ESPCI Paris-PSL. L’ESPCI est une école d’ingénieurs à Paris, spécialisée en physique et en chimie, ainsi qu’en biologie. La formation dispensée est pluridisciplinaire et axée sur la recherche.
La moitié du temps de formation est d’ailleurs consacrée aux travaux pratiques, effectués dans les laboratoires de l’école, également institut de recherche.

Sur quel type de projet travaillez-vous actuellement ?

Nous menons en 2ème année un PSE (Projet Scientifique en Equipe). Dans le cadre de ce projet, notre trinôme travaille sur la mise au point d’un microscope à nappe laser (appelée LSFM pour Light Sheet Fluorescence Microscopy, ou encore SPIM, pour Selective Plane Illumination Microscopy) pour application en biologie. L’objectif est de réaliser un montage optique de microscopie de fluorescence permettant d’éclairer un échantillon biologique par une fine nappe de lumière (light sheet).

Cette méthode permet d’acquérir une image d’un plan de l’échantillon bien plus rapidement que la microscopie confocale, où l’image d’un plan est obtenue point par point. Elle est donc plus adaptée à l’observation de phénomènes nécessitant une bonne résolution temporelle (l’observation de la réponse à une stimulation en neurosciences, par exemple). Elle présente également l’avantage de moins exposer l’échantillon à la lumière laser, et induit donc moins de phototoxicité et de photoblanchiment des fluorophores.

Nous avons ensuite appliqué notre montage à l’observation de pupes de drosophiles, organisme très utilisé pour la recherche en neurosciences. Ce projet interdisciplinaire est à l’interface entre le développement technologique et son application en recherche fondamentale en biologie.

Quelle a été votre démarche de recherche et quelles ont été les points critique ?

Pour réaliser notre montage, nous nous sommes inspirés des travaux publiés sur la microscopie light sheet, et notamment de la plateforme en ligne OpenSPIM, qui donne des conseils et un exemple de montage light sheet.

La nappe de lumière est obtenue par l’inclusion d’une lentille cylindrique dans le montage optique.
L’émission de fluorescence est recueillie perpendiculairement à la nappe laser.

Une fois le montage optique réalisé, l’étape la plus délicate a été la mise au point d’un système de montage de l’échantillon biologique à observer. La pupe de drosophile, incluse dans un gel d’agarose, est suspendue au bout d’une seringue immergée dans l’eau (les objectifs utilisés pour l’illumination et la détection sont à immersion dans l’eau).

Nous avons utilisé des platines de translation de manière à pouvoir déplacer notre échantillon dans les 3 directions de l’espace.

 

 

 

Pourquoi avez-vous sélectionné le LBX-488 de chez Oxxius ?

L’objectif de notre projet était d’observer des pupes de drosophiles exprimant la GFP (Green Fluorescent Protein), un marqueur fluorescent très utilisé en biologie. Nous avions donc besoin d’une source de lumière laser avec une puissance adaptée à l’illumination d’échantillons biologiques, à la longueur d’onde d’excitation optimale de la GFP.

Le LBX 488 de chez Oxxius était parfaitement adapté à nos besoins, c’est pourquoi nous l’avons sélectionné pour notre projet.

 

ZOOM ON

LBX – 488

Laser LBX 488 Oxxius utilisé dans notre montage

Longueur d’onde d’émission : 488 nm (+/- 5 nm) Largeur : ≤2 nm Puissance de sortie : de 40 à 200 mW Stabilité de l’alimentation: + 0.5% Plage de réglage de la puissance : 0-100% Bruit : ≤ 0.2% Diamètre de taille du faisceau : 0.7mm Divergence faisceau : ≤1.2 mrad Facteur de qualité du faisceau : ≤1.25M2 Circularité : ≥90% Stabilité pointage : ≤ 5 µrad/K Etat de polarisation / linear, vertical at +/-5° Modulation digitale: fréquence max de modulation: 150Mhz Modulation analogue : Bande passante ≥3 MHz

 

Avez-vous des premiers résultats à nous partager ?

A la fin de notre projet, nous avons réussi à obtenir des images de pupes de drosophiles avec notre montage de microscopie light sheet.
L’acquisition d’images sur plusieurs plans nous a également permis de réaliser des images 3D plan par plan.

Les images de plans étaient régulièrement espacées à différentes profondeurs dans l’échantillon.
Nous avons ensuite utilisé le logiciel ImageJ pour connaître la distance entre chaque plan, et reconstituer une image 3D à partir du stack d’images de plans.

Notre projet pourrait être utilisé et amélioré par des promotions futures pour observer des échantillons biologiques.
Parmi les domaines d’application, on peut citer la biologie du développement (par exemple, observer le développement d’un organe marqué par fluorescence dans une larve), ou encore les neurosciences (observer la réponse d’une zone cérébrale de drosophile suite à un stimulus, par exemple).